王 阁 论文题目：肝细胞生成素受体及作用机理的初步研究 作者简介：王 阁，男，1968年04月出生，1997年09月师从于第三军医大学房殿春教授，于2000年06月获博士学位。
摘 要
前 言
高等哺乳动物组织再生能力非常有限。肝脏是机体最重要的器官之一，至少承担着5000种以上的生理功能，最具吸引力的是其损伤后惊人的组织修复即肝再生能力。有关肝再生调控的研究已有半个多世纪的历史，1931年Higgins
和Anderson首先全面描述大鼠肝部分切除(Partial Hepatectomy, PH)后再生过程，随着原代肝细胞培养技术的建立和分子生物学技术的发展，对肝再生受内分泌，旁分泌及自分泌的信号调控机理的研究已取得令人瞩目的进展。人们已经认识到：(1)肝再生早期基因的激活由升高于阈值的循环生长因子启动；(2)肝部分切除后即刻出现的快速代谢适应使肝细胞对肝内外生长因子产生反应，并使大量反应性基因激活。大量事实证明，生长因子在肝再生启动及其进程中发挥着举足轻重的作用。近年来人们逐渐集中于寻找具有肝组织特异作用的生长因子，进而发现并克隆了血源性肝细胞生长因子(HGF)。但随后的研究表明，HGF作用的靶细胞非常广泛，而并非如人们最初想象的那样——特异作用于肝脏细胞，专一性地促进肝细胞再生。而真正支持肝细胞完成其再生过程的是一种来源于肝脏自身、特异性刺激肝细胞增殖的小分子物质，即肝刺激物(Hepatic stimulatory substance，HSS)，或称胞源性肝细胞生长因子(Cytosolic HGF，HGF-c)/肝再生增强因子(Augmentor
of liver regeneration，ALR)/肝细胞生成素(Hepatopoietin，HPO)。
肝炎、肝硬化在我国中普遍发病率高、危害严重。尤其是急性肝功能衰竭，有起病急、预后差、病死率高的特点，其预后主要取决于病损肝细胞的坏死程度和再生能力。肝脏是为数不多能够再生的哺乳动物器官，其在受到物理、化学损伤后能够再生，利用肝再生的特性，缓解病毒对肝的损害是肝再生研究的热点之一，因此，预防肝坏死与促进肝再生已成为目前临床肝损伤各种治疗的出发点。以往临床上的治疗措施虽有助于清除体内有毒物质，但无助于刺激病损肝脏的再生，从肝脏本身寻求治疗严重肝病的有效物质一直是人们梦寐以求的愿望。早在七十年代LaBrecque等即报道在哺乳动物再生肝中存在一种特异促肝增殖的细胞活性因子HSS，随后研究表明该因子广泛存在于哺乳动物幼仔肝、胚胎肝及再生肝组织中。HSS分子量为15～20kD的蛋白质，具有热稳定性和器官特异性，在体内外均具有刺激肝源细胞DNA合成的作用
。80年代我国学者陈成伟等应用4～6月人胎肝细胞悬液(h-FLCS) 治疗肝功能衰竭并获得较好疗效，从而推动了此项研究在国内的开展应用。从1989年起，我国学者开始了对胎肝细胞有效成份的分离和纯化，
我国贺福初实验室从80年代始，先后在国内外首次系统地阐明h-FLCS治疗肝衰竭的有效成分；发现第一种特异刺激肝细胞增殖与肝脏再生的hHPO；完成其蛋白质分离纯化与鉴定及其抗体的制备；证明HPO为基因表达产物并构建表达型人胎肝cDNA文库;在国际上首次公开报道hHPO的分子克隆和重组hHPO的研制，并完成其重组品理化性质鉴定；揭示天然及重组hHPO均具有救治肝功能衰竭的作用。
HPO是目前人们已知的唯一特异作用肝细胞或肝癌细胞、具有明确救治肝功能衰竭作用的新型细胞因子，它如何发挥其生物学效应，其作用分子机理如何，其信号转导途径(包括受体，信号转导途径及其所激活的转录因子)的研究是问题的关键，它是否与其它肝再生相关生长因子一样，通过特异的肝细胞受体(膜受体和核受体)介导而发挥其生物学效应的，我们开展了这方面的研究。
第一部分 rhHPO体外促肝细胞增殖活性
本文首次利用基因工程产品rhHPO, 以多种细胞系为靶细胞, 对rhHPO体外的生物学活性进行较全面的研究。
材料和方法
一、材料
二、方法
1.
大鼠肝细胞和人胎肝细胞的分离和培养
2.细胞株的分离和培养
3．细胞增殖检测
(1)MTS法
(2)3H-RdR掺入法
结 果
1.rhHPO对原代培养肝细胞的作用
体外原代肝细胞培养体系(无血清)中，rhHPO可刺激原代大鼠肝细胞、胎肝细胞的增殖(p<0.01)，并呈正向相关；16～24ng/ml剂量时，刺激增殖效应趋于饱和。在24ng/ml剂量时，原代大鼠肝细胞OD492值可增加1.67倍，人胎肝细胞OD492值可增加2.35倍。
2.rhHPO对肝癌细胞的作用
rhHPO在体外剂量为24ng/ml时Smmc7721
DNA合成可增加2.11倍，HepG2可增加7.5倍，HTC可增加4.66倍，具有很明显的促肝癌细胞增殖的作用。并具有剂量效应正相关，其中以对HepG2细胞的刺激效果最好，16～24ng/ml剂量时，刺激增殖效应趋于饱和。
3. rhHPO对GLC-82细胞的抑制作用
为了进一步探究肝脏与肝脏以外的器官对rhHPO的反应性，我们选取了一些造血细胞系，喉癌细胞系及肺癌细胞系作进行了对比。结果发现rhHPO对所选取的这些细胞均无刺激作用，但对GLC-82细胞有较为明显的抑制作用，且具有明显剂量效应负相关，但pHGF无此刺激作用。
讨 论
我们在完成人HPOcDNA克隆、原核表达、鉴定、及纯化，得到纯品rhHPO基础上，进而对其体外的生物学活性进行研究，与国外大鼠ALR生物学活性研究结果不同，rhHPO不仅可促原代培养大鼠肝细胞和人胎肝细胞的增殖，而且对肝源性肝癌细胞系有促DNA合成的作用，但对非肝源性细胞无刺激增殖作用，说明HPO生物学功能具有一定的组织细胞特异性，为认识HPO的作用机理提供了新的思路。另外观察到HPO对肺癌细胞系GLC-82具有抑制其DNA合成的作用，为探究其新的生物活性提供了有益的提示。
HPO特异性地显著刺激肝源性细胞DNA的合成，这种直接刺激作用可能是HPO促肝细胞增殖的重要机理，说明HPO是一种与肝再生密切相关的生长因子，它的体外活性的确立，对进一步研究和开发HPO具有不可忽视的作用，对于阐明肝再生分子生物学机理，临床上寻找真正的特异性支持肝再生的治疗药物都具有重大的意义。
第二部分
rhHPO放射性标记
我们采用的是氯胺-T法经典的标记方法。125I- rhHPO与rhHPO是否具有一样的理化性质，是进行受体结合同位素示踪的基础本实验以肝癌细胞HepG2为对象，采用3H-RdR掺入法测定125I-
rhHPO的生物学活性，同时利用SDS-PAGE，结合放射自显影的方法，对已标记的 rhHPO进行理化性质的鉴定。
材料与方法
一、材料
二、方法
1.标记过程
2.标记蛋白质的分离及纯化
3.标记率的测定
4.125I-rhHPO的保存
5.125I-
rhHPO生物学活性测定
6.125I-rhHPO的蛋白电泳(4)
结果与讨论
1.125I-rhHPO的淋洗分离曲线
125I-rhHPO与游离碘(125I)分离效果较好。
2.125I-
rhHPO的生物学活性和理化性质。
125I-rhHPO于SDS-PAGE电泳显示单一条带，分子量与未标记rhHPO的一致。标记后的125I-rhHPO仍然保持与未标记rhHPO一样的生物学活性。
讨 论
放射性受体配基竞争结合实验是研究受体特性的经典方法, 获得高标记低失活的配基是实验成功的前提。标记的好坏直接影响受体配基结合的分析结果，标记后的配基放射活性太高，预示着配基分子结构的破坏和生物学活性的丧失，标记放射活性太低，易造成假阴性。标记的125I-hHPO放射活性在75～100mCi/mg之间。
以3H-TdR掺入法测定125I- rhHPO的生物学活性，可以监测标记后HPO失活的状态，选择具有高标记低失活的125I-rhHPO进行受体结合竞争实验，才能达到同位素示踪的目的。
利用SDS-PAGE分离蛋白质主要取决于蛋白质分子量大小的原理，对125I- rhHPO和未标记的rhHPO进行蛋白电泳，可以初步判断是否存在125I-
rhHPO理化性质的改变，综合筛选适合进行放射配基结合分析实验的配基，为进行HPO受体的确立及特性研究打下良好的基础。
第三部分 人肝细胞生成素受体的确定及特性
有关HPO发挥作用的具体机理尚不清楚，是否与其它肝再生相关多肽生长因子一样存在膜受体以及是否通过受体介导而发挥生物学效应，国内外至今未见任何报道。放射配基结合分析法是研究受体特性的经典方法，因此我们利用前面具有高活性低失活已碘标记的HPO，通过受体配基结合竞争实验，首次证实HPO膜受体的存在，并对HPO受体的特性进行初步的研究。
材料与方法
一、材料
二、方法
1．大鼠原代肝细胞、人胎肝细胞和细胞株的分离及培养
2．125I-HPO受体结合实验
3．125I-rhHPO与膜受体亲和力的交联反应
4．HepG2上HPO受体的放射自显影
结 果
1．125I-HPO与膜受体结合实验。
通过受体结合实验和结合竞争抑制实验发现, 肝源性细胞包括正常肝细胞(如原代培养大鼠肝细胞、人胎肝细胞和L02细胞等)与非正常肝细胞(如HepG2、HTC和SMMC7721肝癌细胞等)与125I-rhHPO反应具有剂量效应关系，以原代培养大鼠肝细胞、人胎肝细胞和HepG2细胞为代表进行分析。原代培养大鼠肝细胞受体数量为10,000个/细胞，Kd值为2pM； HepG2肝癌细胞受体数量分别为55,000个/细胞， Kd值为0.7pM; 人胎肝细胞受体数量为20,000个/细胞，Kd值为1.4pM。来源于其它组织的非肝源性细胞,如COS-7细胞、K562细胞、 Hep2细胞和 CHO细胞，与125I-rhHPO均无明显的剂量效应关系。
2．125I-HPO与膜受体结合的特异性实验
只有未标记的HPO可竞争抑制125I-HPO与膜受体的结合，并呈剂量效应关系，在浓度为反应浓度的100倍左右时可发生完全竞争抑制，而胰岛素、EGF和TGF-a却不能竞争抑制125I-HPO与膜受体的结合。
3．HepG2细胞HPO受体的放射自显影。
在受体与配基已发生结合的HepG2细胞上，可见以细胞为中心簇集着直径为1～2mm的黑色圆形颗粒，代表125I-rhHPO与膜受体结合后形成的复合物，表明HPO膜受体的存在。
4. 125I-HPO与受体交联反应
结合反应后，加入交联剂BS3，受体与125I-rhHPO复合物在SDS-PAGE上电泳，放射自显影显示分子量大约在90KDa左右，在结合反应时加入100倍未标记HPO，在90Kda无条带出现，而加入EGF不影响复合物条带的出现。已知HPO分子量，因此推测HPO受体的分子量大约为75KD。
讨 论
HPO与肝再生关系密切，能特异刺激肝细胞增殖，促进肝细胞从G0/G1
进入S期，但有关HPO促肝细胞增殖的机理至今国际上尚未见报道。
通过125I标记的rhHPO，观察125I-rhHPO与大鼠肝细胞、人胎肝细胞和肝癌细胞的结合，发现125I-HPO与肝细胞结合位点有剂量效应关系，且有饱和趋向及可逆性，即结合后若再加入大量未标记HPO，则125I-HPO与结合位点的结合下降；另外，其结合具有特异性，即加入胰岛素、TGF-a和EGF，125I-hHPO与肝细胞膜上结合位点不受影响，结果证明肝细胞膜上的特异性位点可能就是HPO的受体，具有高度特异性，可逆性和饱和性。
通过受体结合实验和结合竞争抑制实验发现, 肝源性细胞包括正常肝细胞(如原代培养大鼠肝细胞、人胎肝细胞和L02细胞等)与非正常肝细胞(如HepG2、HTC和SMMC7721肝癌细胞等)上均存在HPO受体,无种属特异性，而来源于其它组织的非肝源性细胞,如COS-7细胞(肾)、K562细胞(血液)、
Hep2细胞(喉)和 CHO细胞(卵巢)等，与125I-rhHPO均无明显的剂量效应关系，提示HPO受体的组织分布和细胞定位具有特异性，这可能是HPO特异刺激肝细胞增殖的作用机理之一。
虽然原代大鼠肝细胞、肝癌细胞和人胎肝细胞上均有HPO的受体，但在数量和亲和力上存在明显的差异。原代大鼠肝细胞上受体的数量少，亲和力低；肝癌细胞上受体的数量多，亲和力高；胎肝细胞上受体数量和亲和力介与两者之间。胎肝含有丰富的造血干/祖细胞和
肝细胞的干/祖细胞，它的正常生理发育需要生长因子定向诱导和分化。正常成年大鼠肝细胞可基本反应肝细胞在正常生理条件下的生长状态，而肝癌细胞是反应肝细胞异常增殖的一种病理状态。HPO受体在不同的生理发育阶段和不同生理病理状态下所表现的不同状况，提示HPO可能是维系肝细胞生长发育最重要的生长因子之一。此作用通过肝细胞膜受体介导，是通过调节受体的数量和亲和力发挥着HPO在肝细胞生长发育中的重要作用。由于肝细胞和肝癌细胞自身可以产生HPO，其膜上又存在特异性受体，表明HPO可能通过自分泌循环方式调控肝细胞的生长发育，受体数目与亲和力的变化或HPO产生的异常可能是肝癌发生的机理之一。
第四部分
HPO受体cDNA的分子克隆
首次在国际上充分确立HPO受体存在和特性基础上，研究工作自然延伸到HPO受体—一种新的生长因子受体基因的分离上，我们利用HPO与其受体特异性结合原理，结合同位素示踪，采用功能性筛选方法，进行了 HPO受体cDNA的分子克隆，获得侯选的HPO受体cDNA阳性克隆。
材料与方法
1.人胎肝表达型质粒cDNA文库
2. COS-7细胞培养
3．文库的分离和筛选
(1)pool的建立
(2)pool质粒提取
(3)DNA转染
(4)受体结合实验
(5) 阳性pool获得
(6)亚pool的建立
(7)侯选HPO受体cDNA阳性克隆获得
结果与讨论
HPO受体基因的分离和其它细胞因子受体基因的分离一样，需要从基因库中筛选，现多采用cDNA文库进行筛选。HPO受体在肝细胞膜上表达量相当低，完成受体蛋白的分离和纯化具有较高的难度，因此我们沿用大多数生长因子受体经典的克隆基因方法进行HPO受体的分子克隆。
设计以配基与受体结合实验为基础的文库排列,结合矩阵筛选方法,可一定程度上克服此类筛选方法的繁琐和耗时,减少工作量,不仅有效地解决质粒文库扩增和保存的问题，也给以后的筛选带来了极大的方便，并可重复用于多种基因克隆的筛选。
用已获得的高标记和低失活的125I-rhHPO作为同位素配基进行受体结合实验，以每个pool的CPM变化进行筛选，及亚pool阳性克隆的CPM值筛选结果。在第1轮筛选时阳性pool(约500个重组子)的CPM值可升高1.68
倍左右，第二轮筛选时阳性亚pool(约1-2个重组子)的CPM值可迅速升高14.5 倍左右，是一个非常有意义候选的HPO受体cDNA阳性克隆，为下一步获得HPO受体cDNA提供重要的实验依据。
第五部分 HPO快速诱导重要肝再生相关基因的表达
前面我们已证实肝细胞中存在HPO自分泌循环，HPO促肝细胞增殖主要通过自分泌循环方式发挥作用，但具体的作用机理如何，是否存在旁分泌的作用方式尚不清楚，围绕这些问题，结合细胞因子对靶细胞的最终效应是基因转录形式的改变，我们观察了大鼠肝部分切除后72小时内与肝再生调控相关早期反应基因的表达，并研究了HPO在原代培养大鼠肝细胞中对这些基因的诱导表达
材料与方法
1.动物模型
2.大鼠肝细胞的分离和培养
3.总RNA的提取
4.PC3和Tec基因的克隆
5.PC3和Tec cDNA探针的制备
6.Northern 杂交
7.PCR
结 果
1.PC3和Tec基因的获得
以PH后1小时大鼠肝mRNA(1.0μg)为实验(tester)
mRNA，对照组mRNA为“驱使”(driver)RNA，经差减扣除后，取1/50产物连接入T载体，转化大肠杆菌，并鉴定阳性重组子，随机挑取52个克隆进行序列分析，经检索，其中42株为已报道序列，其中32株已有报道与肝再生调控相关。表明该EST库中富集了肝再生调控相关基因。42株已报道序列中含2株PC3和Tec基因克隆，与胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)基因出现频率相同，IGBP-1是一种与肝再生密切相关的早期反应基因，因此提示PC3和Tec基因可能与肝再生密切相关。
2.Northern 杂交
为验证PC3和Tec基因的表达是否与肝再生相关，我们首先采用点杂交分析了2/3PH后72h内PC3和Tec
mRNA表达情况，提示2/3PH后PC3和Tec基因的表达增加，进而Northern杂交证实了这一结果，正常肝组织中PC3和Tec mRNA有低丰度表达，2/3PH后1-2h表达迅速增加7-10倍，以后mRNA水平恢复到正常肝组织水平。IGFBP-1在2/3肝部分切除后的表达也迅速增加，其表达时相与报道一致。
3. HPO和EGF对原代培养肝细细胞早期反应基因的快速诱导表达
在原代无血清培养肝细胞中，c-fos, LRF-1的表达很低，加入HPO和EGF后其表达迅速增加，表达高峰出现在HPO和EGF刺激后的0.5-2h之间,
2h后c-fos和LRF-1表达水平基本恢复到刺激前的水平，；以HPO刺激肝细胞后不同时间点RNA反转录产物为模板进行PCR，分别取18、23、28、33循环数扩增产物电泳成像，以半定量的方式检测HPO对PC3和Tec基因诱导表达的情况。在原代无血清培养肝细胞中,PC3和Tec基因呈低水平表达表达(28循环后可见特异表达带)，HPO刺激后其表达迅速增加,高峰在HPO刺激后的0.5-2h之间(23循环后可见特异表达带),
0.5-2h表达迅速增加3-5倍，4h后恢复刺激前的水平, 蛋白抑制剂CXH不能抑制PC3和Tec基因的诱导表达，提示PC3和Tec基因的诱导表达是在新的蛋白质合成之前，表明它们是瞬时早期反应基因。
讨 论
同其它细胞增殖一样，c-fos,c-jun和c-myc等原癌基因也是肝细胞增殖的最早分子学特征，被认为是肝再生启动的标志，而LRF-1和IGFBP-1是特异的肝再生相关瞬时早期反应基因。PC3是1991年Bradbury从PC12细胞(嗜铬细胞瘤株)
cDNA文库中筛选出一种可被NGF特异性诱导的分泌型蛋白，在神经原发育过程中，PC3的表达有严格的空间和时间的限制，具有抗增殖和促分化的作用。超表达PC3基因的NIH3T3细胞生长受到明显的抑制，
PC3被认为是一种NGF特异诱导产生的具有生长抑制作用的瞬时早期反应基因。Tec编码酪氨酸激酶,参与多种细胞因子的信号转导，已有研究证实其在造血细胞的生长和或分化中发挥重要的作用。
我们以大鼠2/3肝部分切除1小时再生肝为模型，通过RDA进行细胞增殖调控基因的研究中获得较高丰度的PC3和Tec基因克隆，提示PC3和Tec基因的表达很可能与肝再生调控相关。
鉴于目前国内外尚无PC3和Tec基因与肝再生相关的报道，我们观察了大鼠肝部分切除后72小时内PC3和Tec基因的表达，并研究了HPO在原代培养大鼠肝细胞中对PC3和Tec基因的诱导表达，证实PC3和Tec是一种与肝再生密切相关的瞬时早期反应基因。
肝再生早期反应基因的激活由升高于阈值的循环生长因子启动，PH后即刻出现的快速代谢适应使肝细胞对肝内外生长因子产生反应，并使大量反应性基因激活，HPO作为特异刺激肝细胞增殖的生长因子，在肝再生启动及其进程中发挥着举足轻重的作用，它的表达水平改变，必定伴随着大量反应性基因激活。c-fos和LRF-1是肝再生相关的瞬时早期反应基因的典型代表，在丝裂原刺激下，c-fos和LRF-1可被快速诱导，它们和Jun蛋白家族成员一起形成不同的异二聚体调节转录激活蛋白(AP-1)的活性，从而发挥不同甚至相反的转录激活效应。我们在体外和体内实验中发现，PC3和Tec与c-fos及LRF-1的诱导表达峰值相互重叠，提示PC3和Tec与c-fos和LRF-1可能在肝再生中有某些相似的转录调控机理，HPO对这些早期基因的激活，证实HPO特异刺激肝细胞增殖的作用机理是通过调控肝再生相关早期反应基因来实现的，这与HGF、EGF和TGF-α等生长因子对早期反应基因诱导情况基本类似。
PC3基因编码蛋白是一种分泌蛋白，与某些肝再生相关的瞬时早期反应基因如IGFBP-1等相似，可能以一种旁分泌作用方式作用于肝非实质细胞，影响细胞因子的表达，间接发挥对肝细胞增殖分化的调节，也提示HPO作用机理中不仅有自分泌作用方式，而且很可能存在一种旁分泌作用方式；此外，PC3基因具有明显的抗增殖和促分化作用，在肝再生早期机体应以表达促增殖基因为主，因此，此时PC3基因的表达可能是作为一种重要的肝组织重建过程中各种细胞定向分化的正性调节剂起作用的，而其抗增殖的作用是否与另一肝再生重要负性调节细胞因子TGF-b有关需进一步研究。Tec蛋白与细胞因子受体的酪氨酸激酶蛋白不同，是另一种胞内的酪氨酸激酶蛋白，是细胞因子信号转导途径过程中另一个重要靶分子，可与Jak2激酶相互作用，共同调节细胞因子诱导的c-fos
的转录激活。HPO对Tec基因的快速诱导表达，提示HPO信号转导的多重性，对肝细胞的生长和/或分化具有重要作用，但具体机理尚不清楚。深入研究PC3和Tec基因与肝再生的关系，将有助于阐明肝再生时细胞增殖和分化的分子机理。
小 结
1.rhHPO
在体外对原代培养大鼠肝细胞、人胎肝细胞和肝癌细胞具有刺激增殖的作用，而对非肝源性细胞无刺激作用，表明其作用具有相对器官组织特异性。
2.采用氯胺-T法对rhHPO进行放射碘标记，获得高标记和低失活的125I-rhHPO。
3.通过受体结合和特异性竞争抑制实验及Scatchard分析，首次证实原代培养大鼠肝细胞、人胎肝细胞和肝癌细胞存在HPO受体,且存在数量上和亲和力的差异。受体分子量约75Kda。
4.证实HPO促肝细胞增殖作用与肝细胞表面此特异性膜受体有关，其受体的组织分布和细胞定位具有特异性，可能是HPO特异刺激肝细胞增殖的作用机理之一。
5.采用功能性筛选方法筛选人胎肝cDNA文库，获得侯选的HPO受体cDNA阳性克隆。
6.HPO在原代培养大鼠肝细胞体系中可迅速诱导瞬时早期反应基因的表达，可能是HPO促肝细胞增殖的分子作用机理之一。
7.首次证实PC3和Tec基因是一种与肝再生调控密切相关的早期反应基因。
Hepatopoietin (HPO), which derived
from liver, is a novel polypeptide mitogen specific for hepatocytes in vitro.
It can rescue acute hepatic failure in vivo and supports liver regeneration. As
the first new cytokinse, it was discovered by our native scholar and a extent
research on its functionary mechanism has great significance . The key of HPO
functionary mechanism to stimulate hepatocyte proliferation is based on its
receptor and signal transduction pathways. Accordingly, receptor and
functionary mechanism for Hepatopoietin were carried out in this study. The
main results were as following:
1. We examined the effects
of rhHPO on cell proliferation of rat primarily cultured hepatocytes, human
fetal hepatocytes and hepatoma cell lines in vitro by MTS and 3H-TdR
incorporation methods. Our results indicated that rhHPO is an important
stimulator of hepatocyte proliferation。We also
found an inhibitory effect of rhHPO on the DNA synthesis of lung cancer cell
lines GLC-82 in vitro, which might provide a valuable indicator for the study
of its new biological activity.
2. The radioactive ligand
analysis is a classical method to identify receptor. rhHPO was iodinated by a Chloramine-T
methods. The specific activity of 125I-rhHPO
was 75~100mCi/mg protein. The 125I-rhHPO
retained the same biological activity on stimulation of hepatocyte
proliferation as the unlabeled HPO. 125I-rhHPO shows the same
molecular weight as the unlabeled HPO measured by SDS-PAGE and autoradiography.
These data show that 125I-rhHPO has the same physical and biological
quality as rhHPO suggesting that it is a good radioactive tracer ligand for
study of HPO receptor.
3. To determine whether HPO
acts via a receptor based on signal transduction, 125I-rhHPO was
used to characterize its binding activity by specific displacement test and
Scatchard analysis in primarily cultured rat hepatocyte, human fetal hepatocyte
and human hepatoma cells. The binding was saturable and specific since it was
replaceable by HPO but not by EGF, TGF-a or Insulin. Scatchard analysis indicated
the presence of a single class of high affinity receptor with dissociation
constant (Kd) of 2 pM, 1.4 pM and 0.7 pM, and a receptor density of about
10,000sites/cell , 20,000sites/cell and 55,000sites/cell in the rat
hepatocytes, human fetal hepatocyte and human hepatoma cells,
respectively. Affinity
cross-linking of the receptor with 125I-HPO revealed a polypeptide
of Mr. approximately 90kDa by SDS-PAGE. Thus, the molecular mass of HPO
receptor was calculated to be about 75KDa. The tissue distribution and cells
location for the HPO receptor was specific. These data demonstrated the
existence of an HPO receptor in hepatocytes and hepatoma cells, which may
accounts for biological effect.
4. There existed a receptor for HPO on hepatocytes derived from liver, which has high affinity and high specificity. By binding tset, we made the molecular cloning of the receptor for HPO. We screened the cDNA library of human fetal liver with functional method, and successfully obtained a positive clone of the receptor cDNA for human HPO to be kept selected.
5. The expression of immediate early gene is very important to rat hepatocyte proliferation from G0 to G1 phase within several hours after 2/3 partial hepatectomy. We investigated the different gene expression within 1 hour after 2/3 partial hepatectomy by representational difference analysis. In the expressed sequence tag (EST) library, we identified that most of these genes are immediate early gene, and found two new gene PC3 and Tec that might be associated to liver regeneration in the EST library. Moreover, We identified that PC3 and Tec gene are rapidly induced after 2/3 partial hepatectomy, the expressing peak is within 1~2 hours after operation. HPO can rapidly induce the expression of these genes (c-fos, LRF-1, PC3 and Tec, etc.) in primarily cultured rat hepatocyte, which might be one of HPO molecular mechanism on stimulating hepatocyte proliferation. This is the first report that PC3 gene and Tec gene are immediate early gene related to liver regeneration.
Key
words: Hepatopioetin, Biological
activity, Receptor Radioactive ligand binding analysis molecular cloning Liver
regeneration, Immediate early gene